Hacia 1534 Pedro de Mendoza, noble y rico cortesano, aunque de poca experiencia marítima, pidió “encarecidamente” a Carlos V le concediera una “Jornada a Indias” a su costo. A Mendoza no sólo le entusiasmaba la idea de participar en la colonización (con el fin de contrarrestar los avances portugueses en el Río de la Plata), sino que llegaba a las Indias con la esperanza de encontrar una cura contra su sífilis. En febrero de 1536, Mendoza fundó a orillas del Riachuelo el fuerte de Santa María del Buen Aire, nombre que se transformaría con el tiempo en Buenos Aires. Sin embargo, la falta de alimentos y la hostilidad de los nativos provocó que los conquistadores abandonaran el lugar cinco años después.

En 1537, uno de los lugartenientes de Mendoza, Juan Salazar de Espinosa, fundó Asunción (en la actualidad, capital de Paraguay), que fue el primer asentamiento permanente en la cuenca del Río de la Plata. Desde su base en Asunción, los españoles fueron gradualmente controlando todo el territorio situado entre los ríos Paraná y Paraguay. Entretanto, las favorables condiciones naturales hicieron que los pequeños rebaños de ganado traídos desde España se multiplicaran y extendieran por la Pampa, creando una situación apta para una economía agrícola estable.