A los hugonotes franceses, vencidos en Francia, les quedó prohibido asentarse en la nueva colonia. En 1614 llegaron frailes franciscanos recoletos para convertir a los aborígenes, pero fueron sustituidos en 1635 por los jesuitas.

La supervivencia de Nueva Francia fue incierta debido a las casi continuas luchas con la confederación iroquesa. En 1608 Champlain se había aliado con los algonquinos y los hurones; pero esta alianza enfrentaba a los iroqueses con sus enemigos tradicionales que abastecían de pieles a los holandeses de Nueva Amsterdam, los hurones. Tras los brutales asaltos de los iroqueses a los campamentos hurones del norte del San Lorenzo en 1648 y 1649, se volvieron contra Francia. El comercio de pieles dejó de ser provechoso y la amenaza a la colonia era ya tan grande que los franceses consideraron su abandono.

En 1663, el brillante ministro de Luis XIV, Jean-Baptiste Colbert, reorganizó Nueva Francia bajo la autoridad directa del rey. El comercio de pieles se otorgó a la Compañía de las Indias Occidentales con carácter de monopolio. La amenaza iroquesa había desaparecido, aunque continuaron los ataques de forma esporádica a lo largo del siglo XVII. El conde de Frontenac, como gobernador, alentó más expediciones hacia el interior; las de Louis Jolliet y Jacques Marquette iban dirigidas a la exploración del río Mississippi (1673) y las de René Robert Cavalier, señor de La Salle, a la obtención de Luisiana (1682).

La situación se complicó aún más con la fundación en 1670 de una compañía británica, la Compañía de la Bahía de Hudson.